基于靶向脂质纳米颗粒的治疗性 mRNA 递送：下一代转化药物
信使RNA（mRNA）最近作为一类新的基因药物出现，用于预防和治疗各种疾病。全球 COVID-19 疫苗的快速开发和临床部署凸显了基于 mRNA 的技术作为治疗新发感染的有用工具的潜力。由于药物递送系统的最新进展，包括将 mRNA 封装在脂质纳米颗粒 (LNP) 中和改进的细胞内递送策略，mRNA 疗法的临床转化已经成为可能。治疗性 mRNA 还可用于治疗遗传疾病、罕见疾病甚至癌症。然而，由于其在肝脏中的优先积累，治疗性 mRNA 的广泛应用受到限制。在本文中，我们讨论了可用于将 LNP 引导远离肝脏并将治疗性 mRNA 精确递送至目的靶细胞的策略。在体内提供治疗性 mRNA 的目标代表了一个重要的机会和许多新可能性的未来。
基于 mRNA 的疗法已经成为一种新的药物类别，它推动了两种获准紧急使用的 COVID-19疫苗的开发和临床使用。在 COVID-19 大流行之前，支持mRNA 的技术主要限于学术实验室。Katalin Kariko 和其他人在 30 多年前探索了 mRNA 的潜力，但事实证明，将 mRNA 作为药物产品很难推进，这主要是因为它在人体给药后能够诱导强烈的免疫反应和快速清除或降解。最近使用脂质纳米颗粒 (LNP) 作为针对 SARS-CoV-2 刺突蛋白的 mRNA 的递送载体，使 mRNA 作为一种药物产品改变了 COVID-19 爆发的进程。
基于mRNA的疗法
mRNA是与基因的遗传序列相对应的单链RNA分子。进入细胞后，外源递送的 mRNA 使用核糖体翻译机制在细胞质中瞬时表达，然后转化为功能蛋白（图 1）。治疗性 mRNA 是在无细胞系统中使用体外转录反应以线性化 DNA 产生的。治疗性 mRNA 可以定制设计以编码某些肽、蛋白质或抗体，以提供疾病特异性治疗。目前，治疗性mRNA 正被开发用于广泛的应用，包括：(i) 蛋白质替代疗法 - 替代有缺陷的蛋白质，以治疗罕见疾病；(ii) 基因组编辑 - 提供基因编辑机器，例如 CRISPR/Cas9；(iii) 抗体生产 - 治疗性抗体和/或细胞内抗体的原位生产；(iv) 细胞疗法 - 将新功能引入造血系统细胞、淋巴样细胞，例如用于嵌合抗原受体 (CAR)-T 疗法的 T 细胞，或用于靶向肿瘤的巨噬细胞；(v) 病毒疫苗 - 向免疫系统提供新抗原（例如针对 SARS-CoV-2 刺突蛋白）。在这些应用中，我们将主要讨论造血系统细胞的特异性靶向。
图1. 体外转录的mRNA治疗药物。
真核细胞配备了多种细胞外和细胞内先天免疫传感器，这些传感器可以将 mRNA 识别为危险信号，并构成治疗性 mRNA 递送的主要障碍。为了应对这一挑战，体外转录的 mRNA 被设计成在结构上与内源产生的 mRNA 相似，这包括许多关键特征：5' 加帽、侧翼为非翻译区的开放阅读框、poly-A 尾以及加入修饰核苷。总体而言，这些重要的 mRNA 结构特征有助于维持稳定性、降低免疫原性和增加细胞内的表达。裸治疗性 mRNA的全身递送是不可行的，因为它能够诱导强烈的免疫原性反应、循环半衰期短（<5 分钟）、易降解、无法穿过细胞膜以及大多数细胞类型的内化几乎可以忽略不计。mRNA 的病毒递送是一种选择，但它存在生物分布差、免疫原性和毒性问题。因此，为了在体内使用治疗性 mRNA，必须首先保护它免受血液中的 RNA 酶的影响，然后特异性地递送到目的细胞，并产生足够量的蛋白质，以达到治疗效果。非病毒递送载体，如 LNP，最近已成为封装基于 mRNA 的治疗产品的领先纳米载体。封装在 LNP 内的 mRNA 受到保护，不受细胞外核酸酶的影响，增加了稳定性，也促进了细胞摄取和内体逃逸。
使用脂质纳米颗粒（LNP）的mRNA递送
用于核酸递送的最先进和临床相关的纳米颗粒是 LNP（图 2)。LNP 能够通过增强的渗透性和保留 (EPR) 效应延长核酸在体循环中的血浆半衰期、增加稳定性并改善在肿瘤组织中的积累。LNP已被证明在递送核酸如小干扰 RNA (siRNA) 方面取得了临床成功。首个基于 LNP 的 siRNA 药物Patisiran (Onpattro, Alnylam Pharmaceuticals) 被美国食品和药物管理局批准用于治疗遗传性淀粉样蛋白转甲状腺素介导的淀粉样变性 (hATTR)，这是一种以神经变性为特征的疾病，源于肝脏中突变体转甲状腺素蛋白(TTR) 蛋白的过量产生。此外，LNP 已经彻底改变了mRNA 的递送，这体现在它们被用于递送编码 SARS-CoV-2 刺突抗原的 mRNA，即由 Moderna/mRNA-1273 和 BioNTech/Pfizer BNT162b1 开发的 COVID-19 疫苗。LNP 既能保护血液中的 mRNA，又能有效地将其输送到细胞的细胞质中。标准的含 mRNA 脂质纳米颗粒 (mRNA-LNP) 配方由四种主要脂质成分组成：辅助融合磷脂、胆固醇、聚乙二醇 (PEG)-脂质和可使用各种快速混合方法（图2）与 mRNA 快速混合的可电离阳离子脂质。每种脂质都具有重要的结构作用，但至关重要的是有助于防止聚集和延长血液循环的聚乙二醇化脂质。可电离的阳离子脂质在颗粒形成过程中捕获 mRNA，并且对于核内体逃逸以及mRNA 释放到细胞质中以进行蛋白质翻译至关重要。胆固醇的掺入通过调节膜的完整性和刚度来增加 LNP 的稳定性。当全身给药时，LNP 的主要限制是 LNP 在肝脏中的定位。对于肝脏疾病，这是可取的，但为了将 LNP 的效用扩展到其它细胞类型，需要重定位策略。使用靶向部分，如配体、抗体、抗体片段或肽，有可能将 LNP 从肝脏部位引导到可接近的特定目标细胞，如造血系统的细胞（即造血干细胞和免疫细胞）。
图2. 靶向mRNA脂质纳米颗粒
使用细胞特异性抗体靶向配体增强 LNP
抗体或免疫球蛋白 (Ig) 是在脊椎动物中发现的 Y 形糖蛋白，负责执行各种免疫相关活动，以结合和中和外来抗原（即病毒或细菌）。免疫球蛋白 G (IgG) 代表人类抗体的主要类别，具有由四个多肽链组成的结构：两条相同的重链和两条相同的轻链通过二硫键连接形成 Y 形结构。在重链和轻链的氨基末端是可变区或抗原结合区。在羧基末端，有一个保守的恒定区。通过精确分解完整的抗体结构，可以分离、工程化和生产新型抗体片段，包括 F(ab')2 和 Fab（抗原结合片段）、scFv（单链可变片段）和 sdAb（单域抗体）。每种类型的片段都保留至少一个抗原结合结构域，这是抗体靶向所必需的。抗体片段比完整抗体小，目前正被用作精确“弹头”，用于将纳米颗粒靶向特定细胞类型。与完整抗体相比，抗体片段具有天然优势，特别是在考虑与 LNP 结合时，包括较低的免疫原性、较小的尺寸和位点特异性工程。抗体片段的替代品也是可能的，包括配体和肽。LNP 的常用抗体偶联位点存在于功能化 PEG 修饰脂质的外侧，在配制过程中引入。谨慎考虑抗体属性是有必要的，因为每种独特的抗体都有可能改进纳米颗粒对特定细胞抗原的靶向作用。对于靶向而言，最重要的是选择目标细胞抗原。对于 LNP 的成功抗体靶向，抗原和抗体都应满足关键标准列表，这些标准总结在表 1 中。
表 1 开发针对细胞表面靶标的抗体时要考虑的关键标准
抗原选择的关键标准 | 抗体选择的关键标准 |
抗原必须对于目的细胞具有特异性 | 抗体应至少对抗原具有低纳摩尔亲和性 |
细胞表面高抗原表达 | 抗体应接近中性电荷 |
在体内，LNP 必须易于接近抗原和细胞 | 抗体必须在结合后触发抗原的内化 |
抗原应具有快速内化潜力 | 抗体应以位点特异性方式附着，不会显著增加 LNP 大小或导致聚集 |
抗原应该能够循环回到表面以避免对正常生理功能的影响 | 缺少 Fc 单元且整体尺寸较小的抗体片段将是首选 |
具有抗体靶向必要标准的一组潜在抗原是存在于造血系统细胞质膜上的抗原，包括 T 细胞、NK 细胞、巨噬细胞和造血干细胞。未来，我们设想使用抗体靶向的mRNA-LNP (t-LNP) 在体内对患者的免疫细胞进行基因工程改造。这些t-LNP 有朝一日可以取代难以制造的体外细胞治疗技术（即免疫细胞中的 CAR 生成或体外造血干细胞 (HSC) 的基因编辑）。体内 mRNA 递送方法将代表更广泛可及、更安全（瞬时 mRNA 与更永久 DNA）和负担得起的替代方案。因此，最近的一项临床前研究报告了使用 t-LNP 将 CD4+ T 细胞体内靶向淋巴器官以实现特定基因编辑的成功。如果 t-LNP 方法能够产生与其体外对应物相当的临床结果，那么该技术将具有颠覆性，因为它将允许立即治疗大量可能有资格接受细胞治疗的患者（单基因疾病、血液肿瘤以及可能的实体瘤）。体内 t-LNP 递送有几个优势：(i) 对于不能总是等待体外生产的肿瘤患者来说，这是一个巨大的时间优势；(ii) 获取优势，因为与离体相比，体内 t-LNP 可以获取患者体内更多的细胞，从患者体内提取足够数量的免疫细胞更具挑战性； (iii) 更具成本效益的潜力。此外，与目前体外细胞疗法所需的更独家和更先进的制药生产能力相比，LNP 的规模放大已通过在生产 COVID-19 mRNA 疫苗中得到证明。
使用靶向 LNP (t-LNP) 生成体内嵌合抗原受体 (CAR)
嵌合抗原受体 (CAR) T 细胞疗法已成为一种新型免疫疗法，其中患者的 T 细胞可以重新编程以表达疾病特异性 CAR，从而精确靶向和杀死肿瘤细胞。尽管用于血液系统肿瘤的 CAR T 细胞疗法已获得 FDA 批准，但复杂的程序和高昂的生产成本仍然是其作为主要肿瘤治疗策略的重大障碍。目前生产 CAR T 细胞的方法需要多个费力的步骤：从患者中分离 T 细胞、体外修饰、选择和扩增修饰细胞，然后将其输回患者体内，这些只能在非常专业的生产中心以非常高的成本进行。为了将核酸递送到 T 细胞中，需要针对多聚体蛋白复合物、分化簇 (CD3) 并触发快速内化的新型抗体（图 3）。CD3 蛋白复合物是 T 细胞谱系的独特标识符，因此抗 CD3 抗体已被有效地用作 T 细胞标志物。在一项开创性的概念验证研究中，已经表明循环 T 细胞可以在体内被使用封装在聚合物纳米颗粒中的 DNA 所产生的白血病特异性 CAR 修饰。在输注后 4 小时内，靶向 CD3 的纳米颗粒与大约三分之一的 T 细胞结合，并抑制了小鼠模型中的肿瘤生长。当使用抗 CD19–41BB CAR 在 B 细胞急性淋巴细胞白血病 (B-ALL) 小鼠模型中进行测试时，该研究的结果与传统的离体 CAR-T 细胞治疗相当。在另一份报告中，与 mRNA-LNP 结合的抗 CD4 抗体特异性靶向小鼠脾脏中的 CD4+ T 细胞（高达 60%）。总之，这些研究为至少在小鼠模型中向 T 细胞特异性递送核酸，以用于基因添加（即 CAR mRNA）和基因编辑（即带有小向导 RNA 的 Cas9 mRNA）的能力指明了方向。此外，使用 t-LNP 进行的类似体内 CAR 递送可应用于其它有希望的抗肿瘤免疫细胞类型，包括 NK 细胞和肿瘤相关巨噬细胞 (TAM)，两者都表现出比 T 细胞在实体瘤中更好的渗透性。
图3. 使用t-LNP的mRNA的体内递送
使用 t-LNP体内调节肿瘤相关巨噬细胞 (TAM)
实体瘤由肿瘤细胞和非肿瘤细胞组成，包括基质细胞、肿瘤脉管系统和浸润性免疫细胞，形成肿瘤微环境（TME）。TME 是一个高度异质性的环境，其中肿瘤细胞已经进化形成复杂的网络，在这些网络中，它们通过细胞间接触和分泌因子与肿瘤和非肿瘤细胞进行交流。由于存在免疫抑制分子，例如可以阻碍抗肿瘤免疫反应的转化生长因子β(TGF β)和白细胞介素-10 (IL-10)，TME 对免疫细胞的渗透、运输和功能提出了一系列挑战。此外，物理障碍（即肿瘤基质、血管破裂和间质液压力）、酸中毒、缺氧和通过细胞-细胞接触的功能抑制也可能导致免疫逃逸。这种复杂的串扰导致了高度免疫抑制的 TME，它在免疫逃避中起着至关重要的作用，并损害了 T 细胞免疫疗法对实体瘤的疗效。因此，需要创新的解决方案来促进免疫细胞渗透并提高免疫疗法治疗实体瘤的功效。
肿瘤浸润性巨噬细胞是 TME 的关键调节因子，它不仅与肿瘤细胞而且与其它浸润性免疫细胞协调复杂的相互作用。根据其体外表型，巨噬细胞可分为两种亚型，M1 和 M2。M1巨噬细胞在炎症和抗肿瘤免疫中发挥重要作用，而M2巨噬细胞（也称为TAM）促进肿瘤进展。TAM 是主要的先天免疫细胞，占 TME 群落的 50% ，大多数研究表明 TAM 浸润与许多人类肿瘤的不良预后呈正相关。用 t-LNP 靶向 TAM 是一种非常理想的治疗途径，具有调节 M2 巨噬细胞介导的免疫抑制的潜力，并可以改善实体瘤的细胞免疫治疗。到目前为止，已经表明，单剂携带小鼠白细胞介素-12 (IL-12) mRNA 的 LNP 能够诱导 IL-12 的局部表达，促进 CD8+ T 细胞和干扰素-γ(IFN -γ)与 TME转化相关的依赖反应。在各种小鼠模型中，IFN-γ反应的诱导与肿瘤消退有关。在另一项研究中，静脉注射由编码干扰素调节因子 5 (IRF5) 的 mRNA 及其激活激酶 IKKβ配制的聚合物纳米颗粒能够逆转 TAM 的免疫抑制性质。这种治疗与巨噬细胞向抗肿瘤发生的表型转换有关，这与卵巢癌小鼠模型的存活率增加有关。总之，这些数据支持这样一种观点，即将 mRNA-LNP 靶向 TAM 可以导致更特异性和更有效的摄取，类似于 T 细胞的抗体靶向方法。然而，TAM 的广泛消耗可能不是理想的治疗方案，因为 TAM 由不同的亚群组成，其中一些具有减缓肿瘤进展的肿瘤抑制能力。CD163 是一种跨膜清道夫受体，在免疫抑制性 TAM 上高度表达。肿瘤内 CD163 阳性 TAM 密度最高的肿瘤已被证明与较差的存活率相关。与 TAM 的泛耗尽相比，CD163 阳性 TAM 的特异性耗尽显示出显著的肿瘤生长抑制。CD163 受体的一个关键特征是它能够在与抗 CD163 抗体结合后迅速内化，该抗体被用来将抗炎药物地塞米松靶向 CD163 阳性 TAM。尽管与载药纳米颗粒结合的抗 CD163 靶向抗体和抗体-药物结合物是有前景的免疫疗法，但 t-LNP 方法可以使用 mRNA 来调节巨噬细胞（而不是永久消耗或改变巨噬细胞）值得研究。
使用 t-LNP 对造血干细胞 (HSC) 进行基因编辑
许多由单个基因变异引起的单基因疾病可以通过造血干细胞 (HSC) 的基因治疗得到治愈，包括免疫缺陷和 β-血红蛋白病。在临床前啮齿动物模型和人类患者中进行的研究表明，可以通过使用慢病毒或逆转录病毒载体对 HSC 进行离体基因修饰，然后将其输回患者体内来纠正缺陷基因。然而，基于 HSC 的基因治疗仍然存在一些挑战，包括生物生产成本、插入诱变以及从患病患者获得 HSC 的难度。随着 CRISPR/Cas9 等可编程核酸酶技术的出现，进行体内治疗性基因组编辑的新策略的开发即将出现。在一项针对 6 名遗传性 ATTR 淀粉样变性患者的小规模研究中，LNP 能够成功地将 Cas9 mRNA 和靶向 TRR 的 sgRNA 递送至肝细胞，从而降低血清 TRR 水平。将来，通过使用易于内吞入 HSC 的抗 CD34 抗体，有可能实现 HSC 的特异性靶向。CD34 抗原在 HSC 表面高度富集。使用这种方法，t-LNP 可以将 CRISPR/Cas9 机制特异性地递送给 HSC，以对特定突变进行基因编辑，无论是离体还是可能通过静脉内或骨髓注射在体内递送。一种更安全、更容易获得且成本更低的体内编辑 HSC 疗法可能是下一代单基因疾病疗法。
挑战
在 COVID-19 疫苗的情况下，LNP 不仅能够递送 mRNA 编码的免疫原，而且脂质还充当佐剂并有助于增强免疫反应。尽管这些免疫反应对于预防性疫苗是有利的，但在蛋白质替代疗法和基因组编辑应用的情况下，它们可能代表了安全问题。LNP 的安全性取决于脂质特性和 mRNA 分子。所用脂质的电荷很重要，因为重复使用某些脂质可能会激活宿主免疫反应。全身给药后，补体蛋白家族或先天免疫受体，如细胞表面的 toll 样受体 (TLR) 可能被LNP 激活，导致 NFkB 激活和 I 型干扰素和促炎细胞因子（如 TNF- α、IL-6 和 IL-1β。细胞内化后，mRNA-LNP 复合物被引导至内体系统，其中 LNP 破坏内体膜导致 mRNA 的内体逃逸。胞质溶胶中 mRNA 的翻译可以激活先天免疫传感器，例如 NOD 样受体 (NLR) 家族、含有蛋白 3 (NLRP3) 炎性体的 pyrin 结构域和视黄酸诱导基因 I (RIG-I) 样受体。这种风险可以通过将 1-甲基假尿苷替代到逃避先天免疫传感器识别的 RNA 序列中并选择非免疫原性和可生物降解的脂质来缓解。此外，PEG 相关的免疫原性，特别是在具有预先存在的抗 PEG 抗体的患者中，可能会影响基于 mRNA-LNP 的疗法的安全性和有效性，这是临床转化的障碍。
基于LNP的 mRNA 递送涉及复杂的机制，这些机制可能在不同的细胞类型中有所不同，并且尚未得到彻底研究。LNP 也可以被细胞胞吐，导致递送效率低下。mRNA 也可以被包装到细胞外囊泡中，不仅可以转移到邻近细胞，还可以转移到远处的器官，并产生可能导致不良影响的蛋白质的新拷贝。尽管已经获得了有希望的结果，并且 LNP 目前代表了治疗性 mRNA 递送的金标准，但 LNP 在肝脏和肝外器官中的选择性积累仍然是治疗全身性疾病的主要障碍。生物相容性和可生物降解的 LNP 和靶向 mRNA-LNP 纳米制剂的开发进展最终将扩大基于 mRNA 的疗法在治疗多种疾病中的应用。
总结和展望
mRNA代表了一种新的递送治疗性蛋白质的方式，这种蛋白质对治疗多种疾病具有很大的前景，而 LNP 代表了最先进的 mRNA 递送平台。
基于 mRNA 的靶向疗法将被开发为治疗其它适应症的最重要的下一代药物之一。由于 mRNA 疫苗的成功，生物制药公司可能会就他们的临床管线展开竞争，许多公司可能正在改变他们的战略方向。预计对 mRNA 和脂质的需求将会很高，公司需要准备好解决这些关键的生产瓶颈，以满足未来的需求。
尽管生产 COVID-19 疫苗所需的所有成分的大规模生产已经成功，但封装 mRNA 的 t-LNP 的生产增加了更多的复杂性。由于 mRNA 生产是在无细胞系统中进行的，因此在哺乳动物细胞培养设施中以传统方式进行生产并不理想，公司需要配备专用设备和符合 GMP 要求的专业设施。此外，生物制药公司需要在整个 mRNA 工作流程中发展专业知识和能力，从确保原材料的供应到大规模生产，这将使它们处于这场技术革命的最前沿。
以前所未有的速度开发用于 COVID-19 的 mRNA-LNP 疫苗为开发 mRNA-LNP 编码疗法铺平了道路，不仅用于新出现的传染病，还用于遗传疾病和慢性疾病，如癌症。我们设想靶向 LNP 将治疗性 mRNA 特异性递送至患病细胞将防止脱靶效应。这将推动对可能改变医疗保健格局的、针对不治之症的安全且负担得起的治疗方法的开发。赋予 LNP 以基于抗体的精确靶向造血系统细胞的能力，有可能成为未来 mRNA 医学的颠覆性步骤。t-LNP 既能扩大有资格接受治疗的患者群体，又能改善癌症或单基因疾病等难以治疗疾病的健康结果。随着小抗体片段的出现以及与纳米颗粒表面的高效、位点特异性结合，靶向纳米颗粒领域有望迅速发展。同时，mRNA 技术的不断发展，包括在 mRNA 中加入 miRNA 靶位点，以消除在非特异性细胞（即肝细胞）中的表达，但在目的细胞类型中保持有效表达，还将有助于在选择性和安全性方面取得改变游戏规则的进步。最后，该领域的一个剩余挑战将是更复杂的靶向纳米颗粒（例如，与抗体结合的 mRNA-LNP）的监管批准、规模放大和生产。由于结构和化学复杂性的增加，需要更多地强调高级表征和标准化效力分析技术，以帮助满足监管要求。抗体和 mRNA-LNP 已经分别成功地实现了放大和生产，但将两者与额外的化学成分结合起来，会在可重复性和成本增加方面带来其它障碍。然而，由于 t-LNP 具有颠覆性的未来医学潜力，预计工业界、学术界和政府将利用各自的资源开辟一条前进的道路。
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原文：U.Iqbal, J.K.Sandhu, Therapeutic mRNA delivery with targeted lipid nanoparticles: next-generation transformative medicines. Cell & GeneTherapy Insights 2022; 8(4), –230.
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